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          Cell Reports|TRIM32/USP11調控ARID1A穩定性以及調控鱗狀細胞癌發生發展

          2020-10-23 00:00:00
          Cell Reports|TRIM32/USP11調控ARID1A穩定性以及調控鱗狀細胞癌發生發展
          詳細介紹:


          青蓮的客戶實在是太啦!

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          2019年的文章年終盤點才剛剛結束,

          緊接著2020年的Paper都已經發發發了~



          下面就跟著小編來看看由中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室劉芝華課題組在Cell Reports雜志上發表的文章TRIM32/USP11 Balances ARID1A Stability and the Oncogenic/Tumor-Suppressive Status of Squamous Cell Carcinoma,系統地揭示了泛素化與去泛素化過程在調控ARID1A穩定性以及鱗狀細胞癌發生并進一步發展中的關鍵作用。
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          泛素化是一種可逆的動態翻譯后修飾,通過E1泛素激活酶、E2泛素結合酶和E3泛素連接酶依次介導完成。大多數發生泛素化修飾的底物蛋白通常會被蛋白酶體(UPS)降解,但有些也會影響它們的蛋白活性、定位以及相互作用等。相反,去泛素化酶通過清除、重編輯底物上的泛素鏈來逆轉泛素化修飾。泛素化與去泛素化修飾廣泛滲透到幾乎所有的細胞生命活動當中,其異常調控與包括腫瘤在內的多種人類疾病密切相關。迄今為止,盡管也有一些線索提供了關于ARID1A泛素化修飾,但是其泛素化與去泛素化穩態的失衡在人類腫瘤中的作用尚不明確。


          發文時間
          2020年1月7

          樣品選擇96例食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織



          實驗設計

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             結果展示
              1.ARID1A主要由C端的泛素-蛋白酶體系統(UPS)進行調控

          為了評估ARID1A在鱗狀細胞癌中是否起到重要作用,研究人員對96例鱗狀細胞癌(SCC)患者進行了IHC分析以檢測ARID1A的表達情況,發現ARID1A的低表達與患者較差預后相關(圖A)。進一步探討在SCC細胞中UPS是否能調節ARID1A,采用蛋白酶體抑制劑MG132處理KYSE30, KYSE180, and NCI-H596三株鱗狀細胞癌細胞系,發現MG132處理后ARID1A的蛋白表達水平顯著升高(圖B)。脈沖追蹤顯示,在永生化的人食管上皮細胞系NE2和NE3中,ARID1A蛋白比在SCC細胞系中更穩定(圖C)。進一步研究發現ARID1A主要由C端的泛素-蛋白酶體系統(UPS)進行調控。

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          為了確定ARID1A通過泛素化修飾的特定賴氨酸位點,在293T細胞中共表達FLAG-ARID1A和血凝素-泛素(HA-Ub),對FLAG標簽下拉的免疫共沉淀物進行質譜(MS)鑒定,檢測泛素化位點,檢測到ARID1A八個泛素化賴氨酸位點(圖A)。為了說明調節ARID1A穩定性的關鍵E3連接酶和DUB,用質譜檢測了FLAG-ARID1A相關蛋白,結果顯示了5種E3連接酶和4個DUB與ARID1A相互作用(圖B)。


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          2、泛素連接酶TRIM32能夠顯著促進ARID1A的泛素化降解

          接下來,研究人員選擇了四種與ARID1A有顯著的關聯的E3連接酶進一步研究。敲除TRIM32, RFWD2, TRIP12, 和 MID2,利用免疫印跡(IB)分析只有TRIM32在不影響ARID1A 的mRNA表達水平的情況下提高ARID1A蛋白表達水平的顯著影響(圖A、B),且在ARID1A高表達的正常上皮細胞及鱗狀細胞癌中,ARID1A的半衰期比其在低表達的鱗狀細胞癌中要高很多(圖C、D)。研究人員經驗證發現TRIM32通過降解ARID1A來促進SCC增殖和耐藥。


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          3、USP11是維持ARID1A穩定的去泛素化酶

          通過質譜鑒定發現4種去泛素化酶與ARID1A相關,數據指示ARID1A與USP11或USP39之間的特定相互作用。利用免疫印跡(IB)分析發現USP11缺失后,ARID1A表達量明顯降低,而USP39缺失未表現出ARID1A的明顯下調。值得注意的是,ARID1A的mRNA表達水平通過USP11或USP39基因敲除保持不變。在鱗狀細胞癌中過表達USP11蛋白可以顯著抑制其增殖與轉移,而進一步敲降ARID1A可以完全逆轉USP11的抑癌功能,說明ARID1A是USP11在鱗狀細胞癌中的關鍵作用底物。通過CO-IP實驗證明TRIM32和USP11可以相互作用,TRIM32的存在顯著降低了USP11與ARID1A之間的關聯。



          4、USP11通過穩定轉移ARID1A來抑制SCC增殖

          為了驗證USP11在SCC中的作用,我們首先在NCI-H596細胞中過表達野生型和突變型USP11,結果顯示野生型USP11能抑制NCI-H596細胞的遷移和侵襲。為了驗證USP11的腫瘤抑制功能依賴于ARID1A,我們在USP11過表達的KYSE30細胞中敲除了ARID1A,結果表明,ARID1A的敲除可消除USP11在KYSE30細胞中的抑癌功能(圖A、B、C)。又進一步驗證證實USP11通過穩定轉移ARID1A來抑制SCC增殖。

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          進一步分析表明,TRIM32高表達水平與預后不良、轉移和晚期病理階段有關,表明其是SCC中的一個關鍵癌基因,并具有可能成為治療靶點。相反,USP11高表達水平與良好的預后相關,盡管它與其他臨床變量沒有顯著的相關性(圖D)。


          5、TRIM32/USP11平衡ARID1A穩態并影響SCC的干細胞、腫瘤發生和耐藥性

          為了探討TRIM32過表達或USP11缺失引起的ARID1A不穩定性如何促進SCC的發展的潛在機制,通過RNA測序(RNA-seq),與對照相比,發現在ARID1A缺失細胞和USP11缺失細胞中均有33個基因顯著上調。重疊的基因中研究人員關注到SDC2,以往研究表明SDC2被認為是SCC的診斷指標。通過一系列實驗驗證證實TRIM32和USP11控制RAD1A的穩定性,且TRIM32能促進腫瘤的形成,而USP11/ARID1A抑制KYSE180細胞在體內的腫瘤形成。研究人員還發現ARID1A的缺失通過激活跨膜受體SDC2的表達來激活癌癥相關信號通路如PI3K/Akt, MAPK, Wnt通路等。


          但其在SCC中的調控和功能機制尚不清楚。我們發現SDC2激活致癌信號,如PI3K/Akt、RAS/MAPK和Wnt/LRP6信號通路,以促進SCC開始和進展。與在細胞核中發揮致癌功能的TRIM32不同,SDC2位于細胞膜上,因此,靶向SDC2的抗體的發展應用于ARID1A低表達的鱗狀細胞癌患者的治療方法具有潛在意義。


          小結
          這項研究系統地揭示了泛素化與去泛素化過程在調控ARID1A穩定性以及調控鱗狀細胞癌發生發展中的關鍵作用。此外,TRIM32與USP11在調控ARID1A蛋白穩定性方面存在拮抗關系,但TRIM32對ARID1A的泛素化和USP11對ARID1A的去泛素化依賴于不同的賴氨酸位點;因而說明ARID1A的穩定性可能取決于TRIM32和USP11的相對表達水平。


          參考文獻
          Luo Q,Wu X,Nan Y,TRIM32/USP11 Balances ARID1A Stability and the Oncogenic/Tumor-Suppressive Status of Squamous Cell Carcinoma.Cell Rep 2020 Jan 07;30(1)


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