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                1. 蛋白質組學

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                  Nature Communication|TRIB3通過抑制FOXO1的降解和增強SOX2轉錄促進乳腺癌的干性

                  2020-10-23 00:00:00
                  Nature Communication|TRIB3通過抑制FOXO1的降解和增強SOX2轉錄促進乳腺癌的干性
                  詳細介紹:


                  中國醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室崔冰、胡卓偉研究團隊發表了題為“TRIB3  supports  breast  cancer  stemness by  suppressing  FOXO1 degradation  and  enhancing  SOX2  transcription”的文章,發現TRIB3通過抑制FOXO1的降解和增強SOX2轉錄促進乳腺癌的干性。


                  TRIB3通過抑制FOXO1的降解和增強SOX2轉錄促進乳腺癌的干性

                  研究背景
                  乳腺癌干細胞的存在是乳腺癌化療、放療后發生轉移和復發的重要原因??紤]到TRIB3可感知多種應激信號,增強的TRIB3表達導致乳腺癌患者預后差,推測TRIB3通過其腫瘤啟動能力參與乳腺癌的發病機制。

                  實驗材料

                  轉基因小鼠上皮細胞;乳腺癌組織;腫瘤細胞系;自發乳腺癌小鼠來源的原代腫瘤及PDX模型。
                  技術路線



                  研究結果

                  TRIB3與乳腺癌的干性有關

                  從數據庫查詢發現乳腺癌患者(n=1556)的TRIB3表達水平高于正?;颊?n = 144),腫瘤組織的TRIB3表達高于鄰近非腫瘤組織(圖1 b)。TRIB3在上皮細胞HMLER與8種不同的乳腺癌上皮細胞系中普遍高表達,但在人乳腺上皮細胞(HMLEs)中不表達(圖1c)。使用在線工具研究癌癥基因組(TCGA)數據庫,根據1117名乳腺癌患者的乳腺癌干細胞BCCs中TRIB3的相對表達水平分為三組,TRIB3 mRNA高表達的腫瘤患者總生存期明顯低于低或中表達患者(圖1d),說明TRIB3表達升高與乳腺癌的進展、轉移和復發呈正相關。IL-6處理提高了MCF7細胞的成球能力(圖1e),IL-6增強了TRIB3在細胞中的表達。從自發性乳腺癌小鼠的分離乳腺上皮細胞(MEC),在管腔型MMTV-PyMT乳腺癌小鼠的CD24 + CD29亞群和CD24 + CD90 +莖狀亞群中、患有her2型MMTV-ErbB2乳腺癌小鼠的CD24 + CD29亞群中以及來自CD68 +腫瘤相關巨噬細胞(TAM)的乳腺癌患者中均發現了TRIB3 mRNA和蛋白表達(圖1f, g)。這些數據表明,升高的TRIB3表達將促進乳腺癌干細胞的細胞因子和其他壓力因素與乳腺癌干性相關。



                  圖1 高TRIB3表達與乳腺癌的總生存期和無轉移生存期呈負相關

                  MMTV-PyMT轉基因小鼠和MMTV-ErbB2轉基因小鼠的上皮細胞中沉默TRIB3 ,形成的球體比對照組少得多(2a,b)。轉染陰性TRIB3的HMLE細胞,會促進球蛋白的形成(圖2e),沉默TRIB3的細胞表現出較弱的球狀體形成能力,可抑制腫瘤生長和轉移(圖2d, f)并降低了免疫缺陷小鼠形成腫瘤的能力(圖2i)。



                  圖2 沉默TRIB3可抑制球狀體的形成和腫瘤的定植

                  TRIB3通過FOXO1轉錄增強SOX2的表達

                  過表達TRIB3的HMLE細胞顯著提高了SOX2的mRNA表達,促進胚胎干細胞關鍵蛋白SOX2、NANOG和癌基因產物c-Myc的表達(3b)。SOX2與三種細胞中TRIB3的表達普遍相關,沉默SOX2減少了HMLE細胞中腫瘤球的形成。在HMLE-TRIB3細胞中,沉默SOX2、NANOG、c-Myc中任何一個都可使腫瘤球減少,然而,僅沉默SOX2完全阻斷了TRIB3促進腫瘤球形成(圖3a-c)。表明SOX2是介導支持TRIB3的乳腺癌干性的主要因素。乳腺癌組織研究發現,SOX2在腫瘤組織中的表達高于鄰近的非腫瘤組織,且TRIB3與SOX2在腫瘤組織中的表達水平相關(圖3d)。TRIB3增強了HMLE細胞和MCF7細胞中SOX2的轉錄活性(圖3e,f)。沉默SOX2表達降低了用表達TRIB3的載體轉染HMLE細胞形成球形(圖3g)。過表達SOX2挽救了沉默的TRIB3在MCF7和MDA-231細胞的球狀形成能力(圖3h)。這些數據提示SOX2表達的升高與TRIB3支持的乳腺癌干性有關。


                  圖3 TRIB3增強了SOX2在BCCs的表達

                  檢測控制BCCs中SOX2表達的主導轉錄因子(TF),在MCF7細胞中對9種不同的SOX2促進因子逐一進行篩選和沉默,發現沉默FOXO1表達(圖4a)而不沉默任何其他TF(補充圖4a)可以降低BCCs中SOX2的表達。沉默FOXO1表達可降低轉染TRIB3表達載體在HMLE細胞中SOX2的轉錄活性和表達(圖4b,e)。FOXO1的過表達挽救了TRIB3沉默的MCF7細胞的SOX2轉錄活性(圖4c)。FOXO1的過表達挽救了SOX2在TRIB3沉默的MCF7細胞(圖4f)和MDAMB-231細胞中的表達。這些數據表明FOXO1增強了TRIB3-過表達BCC中SOX2的轉錄表達。乳腺癌人腫瘤組織的免疫組化分析,FOXO1的表達水平與腫瘤組織中TRIB3的表達水平相關(圖4g)。沉默FOXO1表達則減少了HMLE細胞過表達TRIB3(圖4h)。這些數據表明,FOXO1與SOX2作用相同,共同促進過表達TRIB3乳腺癌的干性。



                  圖4 在BCCs中,FOXO1控制著TRIB3-SOX2軸

                  TRIB3增強了FOXO1的表達

                  在HMLE細胞中,TRIB3顯著提高了FOXO1降解的半衰期(3 ~ 6 h)(圖5a)。沉默TRIB3可使FOXO1的半衰期從3.1小時降至0.8小時。蛋白酶體抑制劑MG132可以抑制FOXO1在MCF7細胞中的降解(圖5c),沉默TRIB3可以降低MCF7和MDA-MB-231細胞中FOXO1的表達(圖5d)。這些數據表明,TRIB3會通過破壞泛素—蛋白酶體系統干擾FOXO1的降解。過表達TRIB3降低了HMLE細胞中FOXO1的S256、T24和S319的磷酸化(圖5e)。沉默TRIB3增強了MCF7細胞中S256, S319處的FOXO1磷酸化,但在T24處沒有(圖5f)。TRIB3抑制了HMLE細胞中S256D FOXO1突變體的泛素化(圖5 g)。這些數據表明FOXO1在S256處的磷酸化是FOXO1泛素化和降解的關鍵信號。過表達FOXO1增加了BCC中腫瘤球的形成,S256A、K463R和S256A K463A突變體FOXO1進一步增強了TRIB3沉默的MCF7細胞中腫瘤球的形成。

                  圖5 TRIB3通過抑制FOXO1蛋白的泛素化來穩定FOXO1蛋白

                  TRIB3持續降低了AKT1的磷酸化,AKT1是一種可以與FOXO1相互作用的激酶,這表明AKT-FOXO1相互作用在TRIB3增強的乳腺癌干性中起著關鍵作用。在MCF7細胞中TRIB3不與FOXO1發生內源性作用,但會消除AKT1-FOXO1在HMLE細胞中的相互作用(圖6)。研究表明FOXO1并不是影響TRIB3的核心因子, TRIB3-FOXO1-SOX2軸的正反饋機制促進乳腺癌干性。TRIB3通過抑制FOXO1的降解來增強FOXO1的表達,升高的FOXO1誘導SOX2的轉錄表達,后者反過來激活FOXO1的轉錄表達。

                  圖6 TRIB3消除了AKT-FOXO1相互作用

                  干擾TRIB3/AKT相互作用可降低癌癥干性

                  Pep2-Ae降低了MMTV-PyMT和MMTV-ErbB2轉基因小鼠的MEC和PDX小鼠的原代BCC的乳腺球群細胞形成能力,對原發性腫瘤的生長沒有顯著影響,但在FVB小鼠和免疫缺陷小鼠中,繼發性腫瘤形成的能力降低。事實上,在MMTV-PyMT MECs衍生的乳腺腫瘤和PDX乳腺腫瘤中,TRIB3/AKT1相互作用被取消。最后Pep2-Ae增強了AKT1和FOXO1的活性,并降低了FOXO1和SOX2在MMTV-PyMT MEC源性乳腺腫瘤和PDX源性乳腺腫瘤中的表達。

                  這些數據證實,阻斷TRIB3/AKT1相互作用可降低乳腺癌干性,并通過促進FOXO1磷酸化、泛素化和降解發揮抗腫瘤作用,從而抑制SOX2的表達(圖7)

                  圖7 TRIB3表達升高促進了BCSCs和乳腺癌的發生發展



                  結論

                  乳腺癌干細胞的存在是乳腺癌化療、放療后發生轉移和復發的重要原因,研究發現高表達TRIB3阻礙FOXO1-AKT相互作用,導致核 內FOXO1和SOX2大量堆積,促進乳腺腫瘤干性增強,加速腫瘤發展進程,提示抑制腫瘤干性可能為降低乳腺癌復發和減少癌細胞耐藥的發生提供新策略。


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