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          凝集素受体样激酶LORE的酪氨酸磷酸化调节植物免疫力

          2020-10-23 00:00:00
          凝集素受体样激酶LORE的酪氨酸磷酸化调节植物免疫力
          详细介绍:

          中国科学院微生物研究所刘俊组罗旭明老师发表了题为“Tyrosine phosphorylation of the lectin receptor-like kinase LORE regulates plant immunity”的文章,揭示了植物识别病原细菌的新机制。通过环环相扣不断深入的研究最终证明了植物模式识别受体LORE感受病原菌携带的中等链长度的3-OH-C10:0,进而引起LORE Y600发生磷酸化,从而进一步激活免疫响应;然而病原菌可以分泌另外一种蛋白HopAO1从而抑制植物免疫。本文中的关键蛋白LORE及磷酸化修饰位点Y600的鉴定得到了青莲百奥质谱平台的倾心助力。下面让我们一起细细品读这一研究成果。640.png


          凝集素受体样激酶LORE的酪氨酸磷酸化调节植物免疫力



          文章思路



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          背景介绍

          在脂质A生物合成过程中释放的游离mc-3-OH-FA广泛存在于假单胞菌中。此外,mc-3-OH-FAs是一组激活拟南芥植物免疫力的关键PAMPs。尽管LORE是mc-3-OH-FAs的关键植物免疫受体,但还不知道LORE如何被激活以及下游免疫成分是什么。本文报道了,LORE的酪氨酸残基(Y600)在暴露于3-OH-C10:0时被磷酸化,酪氨酸磷酸化的LORE随后反向磷酸化特定的RLCK来转导免疫信号。此外,本文也证明了细菌酪氨酸磷酸酶HopAO1抑制LORE的酪氨酸磷酸化,抑制3-OH-C10:0激活的免疫反应。本文阐明了拟南芥中LORE介导的免疫事件的潜在机制,为植物免疫途径提供了新的见解。

          实验结果

          一、LORE的酪氨酸磷酸化对于3-OH-C10:0激活的免疫反应至关重要

          LORE包含细胞外凝集素结构域、跨膜结构域和激酶结构域。该RD(Arg-Asp)丝氨酸/苏氨酸(S/T)激酶的K516和D613残基是对其激酶活性必不可少的保守氨基酸。研究者使用32P标记的三磷酸腺苷(ATP)进行的体外激酶分析表明,LORE是真正的激酶,而K516和D613是两个激酶活性的基本位点,而重组的LOREK516E和LORED613V突变蛋白未能进行自身磷酸化。

          K252a是一种兼具S/T和酪氨酸(Y)激酶活性的非特异性激酶抑制剂,而A23是一种酪氨酸激酶抑制剂。K252a和Mock都强烈抑制3-OH-C10:0触发的ROS爆发(图1A)。抑制激酶活性和酪氨酸磷酸化也显着降低了PTI标记基因FRK1和NHL10的转录水平(图1B),这表明LORE介导的PTI需要激酶活性和酪氨酸磷酸化。
          使用纯化的重组GST-LORE-CD蛋白进行的体外激酶测定显示LORE的丝氨酸/苏氨酸磷酸化,即使酪氨酸磷酸化被A23抑制,也表明LORE是一种双特异性蛋白激酶。A23完全抑制了3-OH-C10:0触发的ROS爆发的观察结果(图1A)。另外使用A23抑制了其酪氨酸的磷酸化,MPK
          3/6磷酸化明显降低(图1C)。640 (2).png


          Figure 1. The kinase activity of LORE is essential for 3-OH-C10:0 sensing.



          二、3-OH-C10:0诱导LORE Tyr600磷酸化

          使用体外激酶测定及液相色谱-串联质谱分析(LC-MS/MS),确定Y600为LORE的磷酸化位点(图2A)。Y600是拟南芥和水稻中G型凝集素激酶中一个保守的酪氨酸位点。体外激酶测定表明,用苯丙氨酸(LOREY600F)取代Y600明显降低了LORE的激酶活性(图2B)。


          尽管在这些植物中LORE Y600在基础水平上被磷酸化,但是3-OH-C10:0进一步促进了Y600的磷酸化(图2D)。值得注意的是,磷酸化水平在15分钟后下降(图2D),表明植物磷酸酶参与了酪氨酸磷酸化的调节。


          三、LORE介导的3-OH-C10:0识别需要LORE Y600磷酸化

          3-OH-C10:0特异性地诱导LORE的Y600磷酸化,那么Y600磷酸化是否有助于LORE介导的3-OH-C10:0的识别。进而研究了具有LORE启动子驱动的LORE,LOREY600F或激酶失活的LOREK516E的突变植株。显示出对3-OH-C10:0的响应而显著破坏了ROS爆发(图2E)。用野生型LORE进行的转化完全补充了突变体的异常表型,而激酶失活的突变体LOREK516E没有(图2E)。与pLORE:LOREK516E相似,pLORE:LOREY600F互补系表现出显着降低的ROS水平。


          研究者进而使用RT-qPCR检测了3-OH-C10:0处理后拟南芥叶片中PTI应答基因FRK1和NHL10的转录水平。实际上,这些基因在pLORE:LORE Y600F互补系中对3-OH-C10:0几乎没有反应。就生长抑制而言,pLORE:LOREY600F互补系对3-OH-C10:0的敏感性与突变体一样,与Columbia-0(Col-0)和LORE互补相比,它们的根系更长(图2F)。

          细菌生长曲线分析表明,Y600对于LORE介导的疾病抵抗至关重要。与pLORE:LOREK516E植物相似,pLORE:LOREY600F互补植物与Col-0和LORE互补植物相比,表现出更高的疾病易感性(图2G)。与其他PAMP一样,用3-OH-C10:0进行预处理可以增强植物的抗病性。因此,检测了是否需要Y600来启动防御反应。用3-OH-C10:0进行预处理可提高LORE互补系的抗病性,但不会增强pLORE:LOREY600F互补系的抗病性。这些结果表明LORE Y600的磷酸化参与3-OH-C10:0感知下游的信号传导。


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          Figure 2. Y600 is a key phosphorylation site of LORE.



          四、LORE与PBL34及其两个类似物相关

          基于预测定位于质膜或RLCKs的蛋白质,因为RLCKs可以转导植物中PRR介导的免疫信号。在鉴定出的与LORE相互作用的蛋白质中,PBL34(AT5G15080)符合标准。


          酵母双杂交证实PBL34与LORE-CD相互作用(图3A)。PBL35和PBL36都与酵母中的LORE相互作用,但PBL39没有,这表明LORE与特定的PBL相互作用(图3A)。使用重组PBL蛋白,结果显示MBP-PBLs成功拉下了LORE-CD,但MBP不能成功(图3B)。此外,通过抗FLAG co-IP和分裂荧光素酶测定,显示了PBL与植物中的全长LORE相互作用(图3C和D)。通过根癌农杆菌介导的转化在本氏烟草叶片中瞬时表达PBL34/35/36-GFP,证明了PBL34/35/36定位于质膜。此外,在本氏烟草中通过BiFC实验证实了与质膜上的PBL相互作用。这些结果表明,PBL34/35/36是参与拟南芥中LORE介导的免疫反应的LORE复合物的成分。

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          Figure 3. PBLs interact with LORE in vitro and in vivo.



          五、pbl34/35/36突变体显示出对3-OH-C10:0的反应降低
          通过用3-OH-C10:0和Pst DC3000处理PBL34/35/36,其中PBL34的表达水平高于PBL35和PBL36,如RT-qPCR所示。然后,检测了pbl34、35、36单突变体,pbl34/35双突变体和pbl34/35/36三突变体对3-OH-C10:0的PTI反应。ROS爆发分析表明pbl34、35、36单突变体对3-OH-C10:0的响应与Col-0相似,而pbl34/35双突变体则显示出稍微降低的响应,而pbl34/35/36三联突变体显示ROS爆发明显减少(图4A)。在pbl34/35/36三突变体中检查了另外两个PTI反应,即FRK1和NHL10转录和胼胝质沉积。如图4B所示,在pbl34/35/36三重突变体中,响应于3-OH-C10:0的FRK1和NHL10的上调显着降低(图4B)。同样,pbl34/35/36三重突变体积累的胼胝质比Col-0少(图4C)。

          用3-OH-C10:0处理可强烈抑制Col-0中的根部生长,但不抑制LORE或pbl34/35/36中的根生长(图4D)。细菌生长曲线分析支持了pbl34/35/36三重突变体表现出PTI受损,因为与Col-0相比,三重突变体中细菌滴度显着更高,而pbl34/35双重突变体中细菌滴度却更高。然而,Pol34在Col-0中的过表达显着增强了抗病性(图4E)。这些结果表明PBL34/35/36参与了对3-OH-C10:0的响应,并且在功能上是冗余的。

          通过启动子驱动的PBL34补充了pbl34/35/36三重突变,从而将抗病性表型完全恢复为野生型水平(图4F)。此外,互补系显示出完全恢复的ROS爆发。与3-OH-C10:0相比,在pbl34/35/36突变体flg22中,ROS爆发的诱导大大降低,而与各自的Col-0对照相比,突变体中几丁质诱导的ROS爆发仅在突变体中受到了损害。但是,在bik1/pbl1突变体中,3-OH-C10:0诱导的PTI反应略有降低。以上结果进一步表明,三个PBL在LORE介导的免疫信号传导中在功能上是冗余的,并且特异性应答3-OH-C10:0而不是其他PAMP。



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          Figure 4. PBL triple mutants exhibited compromised PTI triggered by 3-OH-C10:0.




          六、LORE磷酸化PBL34

          LORE是与PBL34相互作用的真正激酶(图3)。GST-LORE-CD经历了自动磷酸化并直接磷酸化MBP-PBL34,而激酶失活的突变蛋白GST-LOREK516E则不会(图5A)。通过LC-MS/MS检测PBL34的磷酸化位点显示T306/T310被LORE-CD磷酸化。T306和T310位于许多RLCK VII亚家族激酶的保守激活环路中,表明LORE介导的T306/T310的磷酸化激活了PBL34的激酶活性。


          通过将这两个位点突变为丙氨酸(PBL34T306A/T310A,此后称为PBL34-2A)。在体外激酶测定中,该突变大大减弱了MBP-PBL34的放射性信号(图5B),表明T306和T310是PBL34中被LORE磷酸化的两个主要位点。而且,LOREY600F不能像野生型LORE一样有效地磷酸化MBP-PBL34(图5C),表明PBL34的磷酸化取决于LORE的Y600磷酸化。

          由于LORE在体外会磷酸化PBL34的激活环路,研究者在拟南芥原生质体中表达了PBL34和PBL34-2A,然后用3-OH-C10:0处理原生质体。3-OH-C10:0处理使PBL34的磷酸化增加,但PBL34-2A的磷酸化却没有(图5D),表明T306/310响应3-OH-C10:0进行了磷酸化。这些结果表明PBL34的磷酸化在遗传上取决于LORE,并且3-OH-C10:0通过LORE促进这种磷酸化。PBL34从LORE的3-OH-C10:0触发解离依赖于PBL34激酶活性,因为PBL34K180E的激酶失活突变体未从LORE解离(图5G)。除PBL34外,LORE也将PBL35和PBL36磷酸化。这些结果表明LORE与PBL34或其PBL35和PBL36旁系同源物形成复合物,但是该复合物在3-OH-C10:0存在下可以解离。


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          Figure 5. LORE phosphorylates PBL34 at T306/T310 for immune responses.



          七、PBL34的T306/T310磷酸化对于LORE介导的3-OH-C10:0识别的重要性

          在ROS爆发测定中,pbl34/35/36三重突变体显示出对3-OH-C10:0的应答减少;然而,当转化为pbl34/35/36三重突变体时,PBL34而非PBL34-2A挽救了ROS爆发(图5H)。值得注意的是,与LORE或LORE(Y600F)相比,pbl34/35/36和PBL34-2A对3-OH-C10:0处理的响应仍然较弱(图5H)。


          通过RT–qPCR检测了FRK1和NHL10的转录水平,并证明了用PBL34-2A进行的转化未能挽救pbl34/35/36植物中响应3-OH-C10:0的这些转录水平的降低(图5I)。此外,PBL34拟磷酸酶CM-PBL34-2D品系响应3-OH-C10:0表现出增强的ROS爆发。这些发现表明LORE对PBL34 T306/T310的磷酸化是3-OH-C10:0触发的免疫应答是必不可少的。


          八、细菌酪氨酸磷酸酶HopAO1靶向LORE

          假单胞菌分泌的效应物HopAO1是一种靶向EFR的磷酸酶,可在感知EF-Tu的过程中逆转酪氨酸磷酸化,从而导致抑制PTI。本文证明了HopAO1与LORE-CD相互作用,正如MBP和GST-Pulldown实验所揭示(图6A)。使用本氏烟草中瞬时表达的蛋白质进行的Co-IP分析证实了这种相互作用。如图6B所示,HopAO1-FLAG与LORE-T7相互作用,而GFP-FLAG不相互作用。


          另外HopAO1几乎完全抑制了拟南芥或本氏烟草叶中LORE介导的ROS爆发(图6E和C)。相比之下,功能缺陷的HopAO1CS不能抑制该ROS爆发。这些结果显示,HopAO1通过使酪氨酸磷酸化的Y600去磷酸化来抑制ROS爆发。与之一致的是,在雌二醇诱导后,使用3-OH-C10:0预处理过表达雌二醇诱导型启动子驱动的HopAO1的转基因拟南芥植株对Pst DC3000的抗性显着降低(图6F)。这些结果表明,HopAO1靶向LORE,特别是酪氨酸磷酸化的Y600去磷酸化,因此抑制了PTI。
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          Figure 6. Pst effector HopAO1 targets LORE for tyrosine dephosphorylation.

          结论

          植物模式识别受体LORE感受病原菌携带的中等链长度的3-OH-C10:0,进而引起LORE Y600发生磷酸化;磷酸化的LORE进一步转移磷酸化胞内受体类激酶,从而进一步激活免疫响应。但是,病菌可以分泌蛋白HopAO1去除LORE Y600的磷酸化,抑制免疫反应。


          参考文献

          Luo Xuming,Wu Wei,Liang Yingbo,Xu Ning,Wang Zongyi,Zou Huasong,Liu Jun. Tyrosine phosphorylation of the lectin receptor-like kinase LORE regulates plant immunity.[J]. The EMBO journal,2020,39(4).


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