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          蛋白質組學

          北京青蓮百奧生物科技有限公司

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          「青蓮百奧聚焦」新發現-APEX新探針底物Alk-Ph可用于活體酵母細胞中蛋白鄰近標記

          2020-12-15 00:00:00

          蛋白質組學

          今日關鍵詞:APEX探針底物
          抗壞血酸過氧化物酶(APEX)是一種功能強大的工具,可對活細胞中的蛋白質和RNA進行鄰近標記。盡管APEX在哺乳動物細胞中得到了廣泛使用,但由于傳統的生物素-苯酚(BP)底物的標記效率低,限制了微生物領域中的APEX應用。酵母是研究真核細胞生物學的強大模式生物。蛋白質組學 由于BP底物的細胞滲透性差,APEX標記在酵母中并未獲得成功。
          重點來嘍~科研人員開發出新的APEX探針底物,并且利用定量蛋白質組和轉錄組學數據證明了該探針具有良好的空間特異性和更高的覆蓋度。
          蛋白質組學


          2020年5月29日,北京大學化學鄒鵬課題組與國家蛋白質中心楊靖課題組合作成功合成新一代應用于微生物體系的APEX探針底物—炔基苯酚(Alkyne-Phenol,Alk-Ph)。糖基化蛋白質組學
          該研究成果發表在Cell Chemical Biology上題為“A Clickable APEX Probe for Proximity-Dependent Proteomic Profiling in Yeast”。新探針工具Alk-Ph實現了對活體酵母細胞中空間特異性蛋白質組的標記與高通量鑒定,與傳統底物BP相比其細胞壁更具滲透性,可以顯著提高完整酵母細胞中APEX的標記效率。多組學聯合分析

          下面就跟隨小編一起來看看這項新技術吧~漲知識啦~
          蛋白質組學

          技術路線
          結果速遞
          APEX底物Alk-Ph用于酵母中的亞細胞蛋白質組學分析
          研究人員利用炔基代替生物素部分,發展了一種具有良好細胞壁通透性能的新探針—炔基-苯酚(Alk-Ph),在活細胞中進行標記后,帶有探針的靶蛋白可通過點擊化學反應連接上生物素或熒光基團,以便后續的富集或可視化(圖1A)。
          接下來借助定量蛋白質組學技術通過同位素二甲基標記策略來測定樣品之間蛋白質豐度(圖2B),分別在±APEX2和±probe的兩個生物學重復樣本中鑒定出705個和366個蛋白質(圖3C),作者進一步通過ROC分析發現有150個線粒體基質蛋白富集,其中包括142個有線粒體注釋的蛋白質,其余八個可能是線粒體定位有誤或是非特異性結合(圖3D)。

          蛋白質組學圖1:APEX2介導的標記蛋白質組學在酵母線粒體中的應用

          LC-MS/MS鑒定標記肽段上的Alk-Ph修飾位點
          盡管上述MS定量分析已證明在酵母中用Alk-Ph標記APEX2介導的蛋白質具有較高的空間特異性,但仍不可避免地受到非特異性蛋白質吸附的影響。因而作者利用MS直接鑒定Alk-Ph修飾的肽,該肽可以明確分配標記的蛋白質/位點。用帶有可紫外線裂解的苯甲酸酯連接的生物素(Az-UV-生物素)點擊肽,富集生物素標記肽后通過紫外線照射進行光還原,然后利用LC-MS/MS鑒定肽序列和Alk-Ph修飾位點(圖2A),結果共鑒定了56個蛋白質(≥兩個獨有Alk-Ph修飾肽),結合之前蛋白結果共鑒定到酵母線粒體基質中165個蛋白質,特異性高達94%,覆蓋度較APEX2 BP方法高達兩倍以上(圖2C、D、E)。

          蛋白質組學

          圖2:APEX2標記的位點鑒定及酵母線粒體基質蛋白質組分析
          Alk-Ph探針可用于酵母中RNA鄰近標記
          鑒于Alk-Ph探針較高的標記效率,作者推測也可用于酵母中的RNA鄰近標記。分別用Alk-Ph和BP標記表達Su9-APEX2的酵母細胞(圖3A)。三種線粒體mRNA(MT-COX1,MT-ATP9,MT-ATP6)和線粒體rRNA(MT-21S rRNA)為陽性標記,兩個豐富的胞漿mRNA(ACT1和TDH3)作為陰性標記。qPCR定量分析結果顯示Alk-Ph標記的樣品中四個陽性標記RNA的大量富集,而BP標記的樣品中未觀察到陽性標記RNA的大量富集(圖3B)。
           

          蛋白質組學


          圖3:APEX2介導的Alk-Ph 標記線粒體轉錄組
          結論
          研究人員實現了活酵母細胞中使用Alk-Ph對蛋白質和RNA進行鄰近標記,將鄰近標記策略推廣至微生物學領域,并利用定量蛋白質組和轉錄組學數據證明了該探針具有良好的空間特異性和更高的覆蓋度。同時Alk-Ph探針還能揭示APEX在蛋白上的修飾位點,有助于分析膜蛋白的跨膜拓撲結構。
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          可點擊的 APEX 探針用于酵母蛋白質組的鄰近依賴性研究
          期刊名稱:Cell Chemical Biology
          IF:7.739
          樣本選擇:酵母細胞
          取樣策略:Su9-APEX2(無Alk-Ph,輕標,n=2),Su9-APEX2(Alk-Ph,重標,n=2),Su9-eGFP(Alk-Ph,輕標,n=2)
          技術策略:標記蛋白質組學,實時定量PCR

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