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          蛋白質組學

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          「青蓮聚焦」歷“九”彌新——FFPE蛋白質組學解析肺癌特征

          2021-08-12 00:00:00



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          通常情況下,蛋白質組學分析的做法是處理新鮮冷凍的腫瘤組織。然而,由于新鮮冷凍標本的腫瘤收集在總樣本數量方面會受到限制,并且這些樣品往往缺乏足夠長的隨訪信息,導致了其實際的研究意義受限。因此,福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 標本因其長期的穩定性與含有臨床結果的常見信息等優勢,成為回顧性研究中十分有吸引力的資源。來自柏林Max Delbrück分子醫學中心、柏林衛生研究所(BIH)的一組研究人員已經成功地使用質譜儀詳細分析了肺癌組織固定樣本中的蛋白質。并在Nature Communications雜志上發表了題為Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories的研究論文。








          實驗流程





          Philipp Mertins博士等人評估了(磷酸)蛋白質組學在 FFPE 肺組織上的蛋白質提取、量化、預分析和樣本大小的可行性。在比較蛋白質提取方案后,使用的方案并采用串聯質量標簽 (TMT) 方法從肺鱗狀細胞和腺癌中獲取深度(磷酸)蛋白質組,其中含有大于8,000個量化蛋白質和14,000多個磷酸化位點。通過微尺度方法,量化了7,000磷酸化位點,從而能夠分析具有有限樣本量的 FFPE 活檢。Philipp Mertins博士等人還研究了分析前變量(包括固定時間和熱輔助去交聯)對蛋白質提取效率和蛋白質組覆蓋率的影響。他們改進的工作流程提供了關于肺癌中最相關的癌基因、腫瘤抑制基因和信號通路的蛋白質豐度和磷酸化位點調控的定量信息。最后,重點介紹了用于重點臨床研究的全面(磷酸化)蛋白質組分析的 TMT 方法和用于大型隊列的無標記方法。








          結果速遞






          首先比較了三種已發表的從 FFPE 樣品中提取蛋白質的方案,由整體蛋白質組覆蓋率、肺癌相關的蛋白質組覆蓋率以及四次重復的可重復性等方面的結果表明 ,SDS-SP3在三種測試方案中從肺癌 FFPE 樣本中提取蛋白質的效果。



          其次,對新鮮冷凍與福爾馬林固定標本的蛋白質組進行直接比較,結果顯示蛋白質鑒定沒有重大差異,其對蛋白質鑒定質量的影響很小。 使用新鮮制備的福爾馬林固定細胞進行的細胞系實驗也顯示,與新鮮冷凍材料相比,蛋白質組和磷酸蛋白質組覆蓋率只有很小的差異。表明對于大型臨床 FFPE 隊列的蛋白質組學分析的研究設計,固定時間不一定是選擇標準。同時 TMT 技術可以成功應用于臨床 FFPE 樣本,提供有關蛋白質表達和磷酸化水平的相關信息。并且TMT方法非常適合對切除的 FFPE 組織進行研究,通過優化 TMT 技術,即使是少量樣本也能實現深度蛋白質組覆蓋。對于切片的 FFPE 組織,通過 TMT 實驗可以定量檢測到 8000多種蛋白質和超過14000 個磷酸化位點。
          最后對常用 FFPE 蛋白質提取方案、蛋白質組學量化方法和不同 FFPE 樣本類型的樣本量要求進行系統比較,指出LFQ 只需要少量的樣本進行蛋白質組分析,樣本制備時間相對較短,在質譜儀上每個樣品的測量時間最少。因此,LFQ 特別適合研究中等覆蓋率的數百個樣本的大型隊列。然而,對于磷酸化蛋白質組分析,由于對每個樣本的樣本量要求相對較高,該方法受到限制。 TMT 方法可提供更深的蛋白質組和磷酸化蛋白質組,但考慮到用于標記、分級和脫鹽的額外樣品處理步驟,需要相對較高的樣本量和更多的樣本制備時間。而微尺度 TMT 方法的一個明顯優勢就是它提供了對蛋白質組和磷酸蛋白質組水平的深入覆蓋的同時,又不需要較高的樣本量,從而能夠對非常小的臨床標本(例如針芯活檢)進行全面的蛋白質組學表征。




          整體而言,質譜驅動的蛋白質組學LFQ 和 TMT 中常用的量化方法在分析 FFPE 組織方面都有不同的應用,各自具有不同的優勢和劣勢,并在功能蛋白質組水平上提供了多種技術選項來探索癌癥基因的改變。

          FFPE

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